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張鵾教授PNAS又一力作!單細胞測序的」CPU 2.0」時代


- 2017年12月15日20時53分
- 科學文摘 / 基因谷

基因谷

張鵾教授PNAS又一力作!單細胞測序的」CPU 2.0」時代圖片

對單個人類細胞的基因組進行準確的變異檢測和大範圍單倍體型分析一直以來都是測序領域的巔峰挑戰。單細胞測序使我們能在更高的解析度下研究生命的機制。一方面,在像癌症這樣的組織樣本中存在大量具有不同基因組類型的單個細胞,因此需要分析單細胞水平基因組而不是大量細胞的平均值;另一方面,對於非常珍貴的細胞樣品,如人類卵母細胞和循環腫瘤細胞(CTCs),單細胞測序具有無與倫比的優勢;此外,利用單細胞測序,還可以揭示細胞個體在特定時間的演化情況。


正常人類單個細胞DNA含量為6.6pg,相對於測序所需的ug級相當微量,並且獨一無二,「有些DNA一旦錯過就不再」!因此單細胞測序的關鍵一環是全基因組擴增(WGA),常見的方法如,DOP-PCR、MDA、MALBAC等需要用DNA聚合酶對細胞基因組做大量的體外擴增,然後構建文庫進行相對讀長較短的高通量測序。這些方法有兩個明顯的缺點:1,聚合酶的錯誤擴增可以在基因組上產生成千上萬的假陽性。2,短的序列讀長几乎不包含任何單倍體類型信息。

面對這些問題,有沒有更好的解決辦法呢?

張鵾教授的團隊近期在PNAS發表題為「Ultra-accurate Genome Sequencing andHaplotyping of Single Human Cells」文章給出了解決方案。研究人員開發了一個名為「SISSOR」 (微流體反應器法單鏈測序)的方法,用來進行準確的單細胞基因組測序和單倍體分型。

該方法是利用微流體處理器將單個細胞染色體DNA的正負雙鏈進行分離,並將百萬鹼基大小的DNA片段隨機分割成大量的納升級的組分,用於擴增和構建測序文庫,從而實現對同源染色體的互補雙鏈分別進行獨立的測序。這樣就能夠進行Long-range單倍體的組裝,並且還能利用冗餘和單倍體型信息糾正測序錯誤。據文章結果顯示,該方法的糾錯能力可以將單細胞測序錯誤率降低至10-8,並且單倍體片段平均可組裝長度為500kb,重疊群contig達到N50大於7

Mb。該方法性能可以進一步提高,使其擴增更均勻和比對更精確,能夠獲得精準的單細胞基因組序列以及單倍體信息以滿足臨床對基因組測序的不同需求。

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張鵾教授

微流體反應器

微流體反應器應用於單細胞測序其實早有應用,黃岩誼和謝曉亮教授為了精確檢測基因組變異,在2015年報導的emulsion WGA (eWGA)技術即是「emulsion+MDA+microfluidic Chip」的三位一體的結合,無論是擴增的均勻性、基因組的覆蓋度還是假陽性的比例都有明顯的改善。如果說eWGA是單細胞測序的「CPU

1.0」,那麼張鵾教授的方法進行了巧妙的改進,將其升級到了2.0時代。

2.0的顯著的改進可以歸納為兩點:

1,基因組DNA變性成單鏈,並且是Mb級大片段;

2,將大片段通過均勻分布到24個獨立的反應小室中,分別擴增建庫。這好比是做拼圖遊戲,將整個240塊圖形,先區分成24個區域,每個區域做10個圖形的拼湊,大大降低了組裝難度,並且Mb級別的大片段包含了大量單倍體型的信息;另外獨立小室的MDA反應體系更接近單分子擴增,同於eWGA的效果,能使擴增均勻性得到大大提升。

張鵾教授PNAS又一力作!單細胞測序的」CPU 2.0」時代圖片

圖: eWGA:在一個試管中,裂解單個細胞,然後與MDA反應緩衝液混合。用於微流體交叉連接裝置的乳化生成均勻分布的微滴,進行DNA片段擴增(來源文獻3)。

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圖: SISSOR技術:單細胞捕獲,進行裂解,染色體DNA分子以KOH溶液(ALS)分離成單鏈形態。單股DNA分子在24個小室隨機分布。每個小室都被放入MDA反應室。每小室里的擴增分別收集出來,然後加工成單獨barcode的測序文庫。

研究人員使用SISSOR技術對人的PGP1纖維細胞系進行了實測,結果顯示:


1. 單倍體組裝:通過將所有reads比對到參考基因組序列,能夠達到預期的將Mb級DNA片段可視化的呈現,並且能夠將兩條同源的姐妹單體上四條互補鏈區分開來。

2. 提高測序精度:基於SISSOR的單鏈獨立小室的實驗基礎,可以通過比較不同小室的單鏈碎片的單倍體類型來確定互補鏈,並將不同小室的同源序列相互匹配來糾正測序錯誤比率。

論文通訊作者張鵾教授表示,SISSOR是對單細胞測序技術的一次突破,將測序準確性提高了兩個數量級。

對於SISSOR技術的應用前景,張鵾教授介紹道:「這項技術潛在的應用包括對患者血液中循環腫瘤細胞進行準確的檢測,以及對體外受精的健康胚胎進行篩選,此外,利用該技術可以對經過基因組編輯的人體細胞進行檢測,以達到治療的目的。」

隨著前不久「人類細胞圖譜」計劃的開展,單細胞測序的研究熱情必然持續高漲,SISSOR技術憑著其獨特的單倍體型分析優勢,和超高的測序精度必然將成為人們爭相使用的技術。希望通過不斷的完善,為科研和臨床做出更大貢獻。

參考文獻:

1.Single-Cell Whole-Genome Amplification and Sequencing: Methodology andApplications.

2.Ultra-accurateGenome Sequencing and Haplotyping of Single Human Cells.

3.Uniform and accurate single-cell sequencing based on emulsion whole-genomeamplification.


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